研究人员将P14 CD8 T细胞（特异性识别LCMV D^bGP^33-41表位的TCR）与D^bGP^33-41刺激的C57BL/6小鼠脾树突状细胞(DC)共培养，在第0天使用D^bGP^33-41多肽刺激后，慢性刺激模型每两天使用D^bGP^33-41和IL-2刺激，而急性模型仅加入IL-2。结果表明，慢性模型中细胞增殖受到抑制，且凋亡敏感性增加。虽然急性模型中IRs升高，但随时间减弱，而慢性模型中IRs表达更高，且持续表达。而慢性模型中的多种效应因子也更低，但仍高于体内Tex。

随后，研究人员针对体外耗竭模型进行测序，以探究其转录和表观遗传特征。RNA-seq结果显示，在d4时，慢性模型和急性模型定位一致，差异基因仅有634个，而在d7时差异基因达到2844个，表明二者具有相似的起始进程，而是在d7时发生分化，其中急性刺激P14细胞偏向于Tmem表型，而急性模型中则偏向Tex表型。基因富集分析中，体内Tex上调的基因在慢性模型的P14细胞中倾向富集，这些基因与T细胞激活的负调控相关。在针对表观遗传特征的ATAC-seq检测中，两模型中的P14细胞在d4均与Tex共定位，可能是与相关染色质可及性的激活有关。与转录水平一致的是，二者均表现出相似的初始途径，以及在d7出现分化。

在证明体外慢性刺激模型可以体现体内Tex的特征后，研究人员顺利获得CRISPR筛选，希望可以找出调控Tex进程的相关转录因子。结果显示，BHLHE40在慢性模型中高频表达，并且在急性模型中并未出现，提示其可能与T细胞耗竭密切相关。研究人员顺利获得shRNA敲低BHLHE40的方法，发现PD-1、Tim3等多种IRs下调，提示其可能促进IRs的表达。为测试BHLHE40在体内调节CD8 T细胞的功能，研究人员将BHLHE40 shRNA KD的P14细胞转入急性和慢性感染的小鼠体内，发现慢性感染的小鼠中BHLHE40敲低细胞有更强的增殖优势，而在急性模型中并未表现。而且在d31时，BHLHE40敲低细胞中部分IRs表达降低。同时，流式检测结果则表明，BHLHE40敲低促进了P14细胞从Tex中期细胞向Tex祖细胞的分化。

综上所述，本研究建立了一种体外T细胞耗竭模型，可以在很大程度上还原体内T细胞耗竭的特征，虽然不能完全模拟体内T细胞耗竭状态，但仍可用于高通量测序等研究，并因此发现转录调控因子BHLHE40在T细胞耗竭的进程中扮演重要的角色。